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《实用细胞培养技术》总结

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《实用细胞培养技术》总结
谭玉珍主编 高等教育出版社

绪论
1. 为什么要培养细胞? ? ? ? 细胞是机体的基本结构与功能单位,即用细胞做实验,可以模拟体内生理过程; 高等生物由多细胞组成,整体条件下研究单一或一群细胞在体内的功能十分困难; 可利用培养的细胞进行吞噬、运动、分裂、膜运输、大分子物质合成等细胞活动和功能。

2. 什么叫细胞培养? ? ? 细胞培养通常指的是体外培养,包括细胞培养、组织培养和器官培养; 细胞培养是指通过酶消化、机械、化学等方法从组织分离的细胞、原代或继代细胞、细胞系或细胞株的培养。

第一章 细胞培养的基本条件
1. 维持细胞体外生存的必要条件? ①严格的无菌无毒环境。体外培养的细胞缺乏对微生物和有毒物质的防御能力,一旦被污染即会死亡; ②合适的营养物质。培养基可为细胞提供生长和增殖说必需的营养物质和促进因子。血清是培养基中的最重要成分之一; 注意:一般干细胞培养时不加血清,血清中的促生长因子可促进干细胞分化。 ③合适的生存环境。包括恒定适宜的温度(~37℃) 、pH(7.2~7.4)和气相环境(主要是 O2 和 CO2) 。 2. 细胞培养室的气体循环和压力? 正压:一般情况下,利用风机,使得进入实验室的空气进行循环和过滤,并使室内形成正压; 负压:如使用危险材料时,应维持室内负压状态。 3. 天然培养基和合成培养基的区别? 天然培养基 来源 组分 特点 动物体液或从组织中分离提取 凝固剂(血浆) 、生物性体液(血清) 、组织浸出液(胚胎浸出液) 、水解蛋白 成分复杂,制备繁琐,个体差异大,易受支原体污染 合成培养基 人工配制而成 根据需求 制备繁琐,成本较高,细胞生长缓慢

血清:*凝固析出的浅黄色透明液体,与血浆的唯一区别是血清中不含有纤维蛋白原等参与凝血反应的物质。 血清主要成分:血浆蛋白(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等) 、氨基酸、脂类、碳水化合物、无机离子、生长因子和激素。 4. 几种常见的合成培养基及其适用情况? MEM:成分简单,适合多种细胞单层生长; DMEM:营养成分较高,有利于高密度细胞培养;分为高糖型和低糖型,高糖型适用于附着性差的肿瘤细胞贴壁生长; 注意:培养杂交瘤细胞时,需加入丙酮酸钠和β-2-巯基乙醇,以促进丝裂原反应和 DNA 合成。 IMDM:为高糖型培养基,可用于杂交瘤细胞的筛选培养; F12:营养成分低,适用于单细胞的低密度克隆化培养;DMEM/F12 1:1 混合,是神经生物学最常用的培养基; RPMI1640:适用于多种正常细胞和肿瘤细胞的生长,也用于悬浮细胞的培养; M199:成分复杂,仅能维持体外细胞的短期生存,现在很少用; L15:含有高浓度氨基酸,有助于提高缓冲能力;可用于周围神经元的培养,也适用于快速增殖肿瘤细胞的培养; McCoy 5A:专门用于肉瘤细胞的培养; Fischer 培养基:主要用于白血病相关的细胞的培养。 5. 什么情况下使用无血清的培养基? 细胞原代培养、细胞克隆化培养、生长因子和单克隆抗体等生物制品生产、细胞分泌物等研究和制备过程,希望除去培养基中不易控 制或易受污染的天然组分。

6. 常用的 PBS 和 HBSS 的区别? ①组分上的区别(单位为 g/L)
组分 PBS HBSS NaCl 8 8 KCl 0.20 0.4 无水 CaCl2 -0.14 MgCl2· 6H2O -0.1 MgSO4· 7H2O -0.1 Na2HPO4· H2O 1.56 0.06 NaH2PO4· 2H2O --KH2PO4 0.2 0.06 NaHCO3 -0.35 葡萄糖 -1 酚红 -1ml

PBS 中没有酚红,而 HBSS 中有酚红,因此 PBS 往往是无色的,而 HBSS 显红色(酚红:指示溶液酸碱性变化。 ) 。 PBS 中没有 Ca2+和 Mg2+,而 HBSS 中含有;高压灭菌时,pH 应调至 6.5,以防止 Mg3(PO4)2 和 Ca3(PO4)2 沉淀; HBSS 含有葡萄糖,灭菌压力不能太高,葡萄糖只能在 10 磅条件下维持 15~20 分钟,因此可用过滤或间歇灭菌法消毒。 ②在功能上 细胞传代时,先用不含 Ca2+和 Mg2+的 HBSS 或 PBS 清洗细胞,随后用胰蛋白酶消化,最后直接加培养基。 因为 Ca2+和 Mg2+会影响胰蛋白酶的活性,因此一开始必须使用没有 Ca2+和 Mg2+的清洗液,消化之后,应该及时终止,而培养基 中含有血清,血清中含有蛋白酶抑制物,同时培养基中往往含有 Ca2+和 Mg2+,因此消化液可以不用吸走。 7. 三种消化液对比 胰蛋白酶 适用情况 常用浓度 最适 pH 特别说明 水解细胞间的蛋白质,使贴壁生 长的细胞脱落并分散为单个细胞 0.1%~0.25% 8~9 Ca2+和 Mg2+会影响活性 EDTA 溶液 能够破坏细胞间的连接 0.02% ~7.4 EDTA 不能被血清中和,应彻底吸净后加培养液 胶原蛋白酶溶液 一般用于上皮细胞的原代培 养,消化对象为胶原蛋白 0.1% 6.5 不受 Ca2+和 Mg2+影响

备注:对于某些贴壁比较牢固的细胞,可将 EDTA 和胰蛋白酶联用。

第二章 细胞培养的基本原理和技术
1. 细胞体外生长方式? 贴壁生长:绝大多数细胞。贴壁的过程:黏附、铺展、迁移、增殖、分化等。 悬浮生长:白细胞、淋巴细胞和某些肿瘤细胞,如白血病细胞。 2. 培养细胞的生命期 原代培养:原代细胞具有异质性,细胞相互依存性前。细胞能够分裂增殖,但并不旺盛,并多呈二倍体核型。 传代培养:细胞增殖旺盛,维持二倍体核型。 注:原代培养期和传代培养早期是细胞冻存的最佳时期。 衰退期:细胞仍然生存,但增殖缓慢或不增殖,最终衰退凋亡。 细胞转化:在传代培养末期或衰退早期,受某种因素影响,细胞可能发生转化,标志之一是细胞获得永生化。永生化的细胞,核型 大多变成异倍体。 3. 培养细胞的一代生存期 培养细胞的一代生存期:细胞接种至细胞传代的时间 潜伏期:细胞对分离操作引起的损伤的恢复期和对新生长环境的适应期。 指数生长期:细胞以指数方式生长,为细胞生长最旺盛或增殖最活跃的阶段,是进行各种实验的最佳时机。 *台期:细胞完全汇合后,生长空间消失,出现接触抑制。 停滞期:细胞因营养不良和代谢产物积累,发生酸中毒,出现形态改变或从底物脱落死亡。 4. 影响细胞生长的主要因素 ①培养基的营养成分和酸碱度; ②细胞外基质:作为细胞附着的介质,是贴壁依赖细胞黏附和生长所必需的。 常用的细胞外基质:Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、明胶、多聚赖氨酸、多聚左旋赖氨酸(PLL) 。

③温度和湿度 ④气相环境:O2 和 CO2。 ⑤其他因素:无毒无菌。 5. 植块培养法与细胞分离培养 植块培养法:从组织块获得培养细胞,而不需要分离细胞; 细胞分离方法:机械分离法、酶消化分离法、化学分离法。

机械分离法 定义 通过物理方法从组织分离单个 细胞 质地较软、含纤维成分较少和 适用 对吹打耐受较强的组织、如胚 胎组织、成年的脑组织和肝组 织、某些软肿瘤细胞

酶消化分离法 通过蛋白酶消化将组织分散成为单个细胞 胰蛋白酶:细胞间质较少的软组织,如胚胎组织、羊 膜、肝组织、肾组织等,也适用于传代细胞的分离; 胶原蛋白酶:纤维性组织、上皮组织以及癌组织 透明质酸酶:细胞表面的糖基 Ca2+和 Mg2+对多数蛋白酶有抑制作用,血清中的蛋白

化学分离法 通过化学螯合剂分离细胞 螯合剂与细胞间质中的二价阳 离子如 Ca2+和 Mg2+等螯合形 成螯合物,从而破坏细胞连 接,促进细胞分离。 EDTA 作用比较缓和,很少单 独用于组织细胞分离,常与胰 蛋白酶配制成混合消化液。

备注

酶抑制物也可抑制蛋白酶活性。但胶原蛋白酶对 Ca2+、Mg2+以及抑制物不敏感。

6. 细胞活性检测 台盼蓝染色法:主要利用台盼蓝对细胞的选择性。台盼蓝不易进入活细胞;细胞死亡后,细胞膜通透性增大,台盼蓝可以进入。 其他染料:萘黑、藻红。 MTT 比色法:MTT 在不含酚红的培养液中溶解呈黄色。活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能将 MTT 黄色溶液氧化还原为蓝紫色不溶于 水的甲臜结晶。用酸性异丙醇或 DMSO 溶解甲臜结晶后,再用酶联免疫检测测定吸光值,可判断细胞的代谢水*。 7. 细胞增殖的检测 细胞计数法 细胞计数法 通过技术细胞悬液 中的细胞数目,以 测定细胞增殖程度 和调整细胞浓度。 计数细胞后,根 据*均细胞浓度 绘制细胞生长曲 线 WST-8 检测法 WST-8 类似于 MTT,可被 线粒体内脱氢酶还原生成 具有高度水溶性的橙黄色 甲臜产物,其颜色深浅和 细胞数目呈线性关系 细胞生长曲线法 [3H]-TdR 将用[3H]标记的胸腺嘧啶 脱氧核苷掺入到新合成的 DNA 中,通过测定[3H] 放射性脉冲数比较不同细 胞的增殖活性 BrdU 将 BrdU 磷酸化形成 BrdUTP, 其作为前提掺入 DNA,代替 dTTP。BrdU 被掺入到 DNA 复 制位点,这些复制位点可用荧 光剂或酶标记的抗体检测

8. 细胞被支原体污染检测 相差油镜观察:直接取培养支持物或取少许细胞培养液制备滴片,覆以盖玻片后,用 1000 倍相差油镜观察。如有支原体污染,镜下课 件支原体呈暗色微小颗粒,多位于细胞表面或细胞之间,其活动类似于布朗运动。 DNA 荧光染色:Hoechst33258 可与 DNA 特异性结合。这是最可靠和最简单的支原体检测方法。

其他
饲养层细胞 饲养层细胞就是指一些特定细胞(如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞) ,经有丝分裂阻断剂(常用 丝裂霉素)处理后所得的细胞单层。一般铺在明胶层上(也可不铺) 。饲养层细胞大部分可用 MEF(小鼠胚胎成纤维细胞) 。 不论 ES 细胞或 EG 细胞,原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌他们在体外存活增殖所必需的生长因子的饲养层细胞。 不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同,但都要求培养过程中的饲养层细胞不分裂不增殖而仍保持代谢活性。是细胞培 养,尤其是胚胎干细胞培养常用的生长增殖促进剂和分化抑制剂。 Giemsa 染色 Giemsa 染色也是最常用的染色方法之一, 适用于多种细胞和染色体染色。 其主要用 Giemsa 染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色,

胞浆染成粉红色,在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。 Giemsa 染色的基本材料为:Giemsa 粉 0.5g,甘油 22mL,将 Giemsa 粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合,研磨至无颗粒; 然后将剩余的甘油混在一起,56℃保温 2 小时后,加入 33mL 纯甲醇,保存于棕色瓶内。 染色的基本步骤为: (1)准备染液:用 pH6.81~7.38 的 Sorensen 缓冲液,按 1:9 比例取 Giemsa 染液和 Sorensen 缓冲液混合配成染色液; Sorensen 缓冲液的配制: pH6.81:Na2HPO4(1/15M) 50mL + KH2PO4(1/15M) 50mL; pH6.98:Na2HPO4(1/15M) 60mL + KH2PO4(1/15M) 40mL pH7.17:Na2HPO4(1/15M) 70mL+ KH2PO4(1/15M) 30mL; pH7.38:Na2HPO4(1/15M) 80mL + KH2PO4(1/15M) 20mL。 (2)细胞标本用甲醇固定 10 分钟,或用 1:3 醋酸/甲醇固定 30 分钟,用滴管把染色液布满玻片上,注意不要有气泡,用染色缸染色 亦可,染 10~15 分钟; (3)用自来水冲去玻片上多余的染料,自然干燥,二甲苯透明,光学树脂胶封固。 染色液宜现用现配,保存时间不超过 48 小时。缓冲液 pH 值要准确,否则影响染色效果。用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的 氧化后,再进行染色。染色完毕将标本浸入水中洗除染液。 Giemsa 染色光镜下观察细胞核呈紫红色或蓝紫色,细胞浆成粉红色 Giemsa 染色法基本成分仍然是伊红和亚甲蓝,改进了染料的质量,使细胞核着色好,结构显示更清晰,而胞浆和中性颗粒染色较 差。染料中的亚甲蓝是碱性的,伊红是酸性的。 酸性染料的生色基团是硝基(-NO2)和醌基; 碱性染料的生色基团, 包括着偶氮基(-N=N-) 胺基〔或吲达胺基(-N=)〕 。染色的原理是基于在酸性染料中具有染色作用的阴离子和细胞内的碱性物质相结合,而碱性染料中的阳离 子和细胞内的酸性物质相结合,所以酸性的细胞成分被碱性染料所染色,而碱性的细胞组分则被酸性染料染色。 母液配制后放入冰箱可以长期保存,一般刚配制的母液染色效果欠佳,保存 2-3 周后再用较好。如果室温放置 不同浓度乙醇的用法: 75%:进入培养室后用 75%乙醇洗手,灭菌; 70%:对实验用品进行灭菌。实验用品需经过 70%的乙醇擦拭后才能带进无菌操作台; 100%:酒精灯 如何避免污染? 分离培养细胞最重要的是避免污染,P163 中,神经胶质细胞的培养,翻转培养瓶,吸出瓶中含未贴壁细胞的培养液? 原因:避免成纤维细胞的污染,成纤维细胞贴壁比较快,半个小时足够了,利用贴壁所需时间的长短,来分离纯化所需的细胞。 简要叙述与自己研究方向相关领域的干细胞研究的最新进展。 (10 分) 哺乳动物胚胎干细胞研究进展: ? 胚胎干细胞相关的分离培养技术 4 月 Midori 等在 Scientific Report 上揭示,他们从人类胚胎干细胞中分离出了一种可以自我更新的血管周细胞的祖细胞。 ? 胚胎干细胞发育调控

2 月 Roberta 等在 Cell 上揭示, 小鼠胚胎干细胞中, 敲除 c-myc 和 N-myc 基因或药物抑制 Myc 活性可急剧降低转录, 剪接和蛋白合成, 进而抑制细胞增殖,揭示了 Myc 基因在胚胎干细胞发育中的重要作用。 4 月 Ying Liu 等在 Nature Communication 上的文章揭示,在精原干细胞和祖细胞中,对于胚胎干细胞维持和分化必要的启动子上富含 组蛋白 H3K4me3/K27me3,即表观遗传修饰可以调控胚胎干细胞的分化。 ? 胚胎干细胞定向分化和重编程

3 月 Mubeen 等在 Cell 上揭示,在小鼠胚胎干细胞中,转录因子 Oct4 和 Sox2 的差异性表达从 4 细胞期就开始,并且对于细胞分化的 命运决定具有重要作用,即转录因子的差异性表达可以调控胚胎干细胞的定向分化。 3 月 Jiwon Jang 等在 Cell 上揭示,PAN 轴的激活可诱导人胚胎干细胞分化为神经外胚层。 3 月 Hui Zhang 等在 Cell Stem Cell 上揭示 MLL1 抑制可将外胚层干细胞从编程为自然状态的多潜能性干细胞。




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